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产品介绍 荧光定量PCR（qPCR）一种实时监控核酸扩增的技术——在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程，。主要用于基因表达分析和病原体检测。 应用领域 1、基础分子生物学研究
2、临床医学诊断与研究
3、药物研发与疗效评价
4、农业与植物科学研究
5、食品安全与环境监测
6、中医药研究领域 技术原理  分析内容 第一阶段：数据获取与质控
这是确保后续分析可信的基础。 1、检查扩增曲线和熔解曲线 扩增曲线：确认所有目的基因和内参基因的曲线呈现标准的“S”形，平台期平稳。排除异常曲线（如起跳过早、平台期骤降、形状怪异），这可能提示污染、抑制剂或引物二聚体。 熔解曲线：确认每个反应只有一个尖锐的单一峰。出现双峰或宽峰可能提示非特异性扩增、引物二聚体或基因组DNA污染。 2、 评估扩增效率 斜率：理想斜率为 -3.32（对应100%效率）。通常可接受范围为 -3.1 ~ -3.6（效率90%~110%）。 R²值：反映标准曲线的线性度，应 > 0.99。 效率：计算公式为 Efficiency = [10^(-1/斜率) - 1] * 100%。 3、 确定阈值线（Threshold）和Ct值 阈值线：通常由仪器软件自动设置在扩增曲线指数期的早期阶段，所有反应基线噪声之上。同一组实验中所有基因的分析必须使用统一的阈值线。 Ct值：每个反应孔扩增曲线与阈值线相交时所对应的循环数。记录所有样品目的基因和内参基因的Ct值。 第二阶段：相对定量分析（最常用） 以研究基因表达差异为例，常用 ΔΔCt法。 1、内参基因均一化 目的：消除样品间加样量、RNA质量、反转录效率等非生物学差异。 计算：对于每个样品，计算 ΔCt = Ct(目的基因) - Ct(内参基因)。 注意：内参基因必须经过验证，其表达在处理组和对照组间稳定。 2、对照组校准 目的：将处理组（实验组）的表达量相对于对照组（如未处理组、0时刻组）进行标准化。 计算：选择对照组ΔCt的平均值作为 校准因子。 对于每个样品（包括对照组自身），计算 ΔΔCt = ΔCt(样品) - ΔCt(对照组均值)。 3、 计算相对表达量（Fold Change） 公式：相对表达量 = 2^(-ΔΔCt) 解读： 结果 = 1：表示表达无变化。 结果 > 1：表示表达上调（例如，2.5表示上调1.5倍）。 结果 < 1：表示表达下调（例如，0.4表示下调至对照组的40%，即下调了1.5倍，常表示为 -1.5倍）。 第三阶段：统计分析 1、生物学重复和技术重复 生物学重复：来自不同个体或独立培养的样品，反映生物学变异，必须进行。通常至少需要3次。 技术重复：同一样品在同一板上的重复加样，反映操作和仪器变异，建议进行（通常2-3次）。 数据处理：先对技术重复取平均值或中位数，得到每个生物学重复的最终Ct值或表达量。 2、 统计检验 将处理组的相对表达量（2^(-ΔΔCt)值）与对照组的“1”进行比较。 常用方法： 两组比较：Student‘s t检验（数据符合正态分布）或Mann-Whitney U检验（非参数）。 多组比较：单因素方差分析，若显著则进行事后检验（如Tukey， Dunnett‘s）。 结果呈现：通常以“平均值 ± 标准差（SD）或标准误（SEM）”的形式展示，并在图表中用星号（*）标注显著性水平（如 *p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001）。 研究结果 咨询我们 |
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